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　　2025年10月16日，西湖大学生命科学学院、西湖实验室及遗传物质表达与重构全国重点实验室卢培龙团队，联合西湖实验室/西湖大学李波、黄晶等团队在Cell期刊发表题为“De novodesigned voltage-gated anion channels suppress neuron firing”的研究论文。经过六年系统攻关，研究团队在国际上首次实现了电压门控阴离子通道（de novodesignedvoltage-gatedanionchannels, dVGACs）的精确从头设计。该人工通道的离子选择机制与电压响应机制均不同于天然离子通道。研究通过生化分析、冷冻电镜结构解析、膜片钳电生理记录及分子动力学模拟，全面验证了其结构与功能，并在小鼠模型中证实其可有效抑制神经元电活动。该成果不仅表明科学家已具备从头设计具有“动态开关”功能的跨膜蛋白的能力，更证明此类人工蛋白可在活体动物中发挥生理作用，标志着人工智能驱动的生物分子设计向实际应用迈出了关键一步。

　　随后，团队利用ProteinMPNN设计可溶性蛋白的氨基酸序列，并通过AlphaFold2预测其三维结构，筛选出与目标模型高度匹配的候选序列。在此基础上，通过重设计候选蛋白的表面残基，将其亲水表面转化为疏水表面，最终获得8个结构与预测模型高度一致的跨膜蛋白设计体。这些蛋白的基因被合成并在大肠杆菌中成功表达，其中跨膜蛋白tmZC8表现出良好的性质。为解析其三维结构，研究团队将tmZC8与KCTD1蛋白的同源五聚体BTB结构域在N端融合，构建融合蛋白tmZC8-BTB。冷冻电镜解析结果显示，tmZC8-BTB的整体结构与设计模型高度吻合，跨膜区Cα原子的RMSD仅为1.33 Å（图2），验证了设计的准确性。

　　研究团队在从头设计的跨膜五聚体蛋白tmZC8-BTB的孔道内引入带电氨基酸（如精氨酸，Arginine），作为门控残基，以赋予其电压敏感性和离子选择性。孔道中的精氨酸残基形成一个狭窄区域，兼具电压感应和离子选择功能：既作为电压传感器（voltage sensor），又充当离子选择过滤器（selectivity filter）。膜片钳实验表明，其中一个设计变体tmZC8-3R-BTB（含R157、R161和R165三个精氨酸突变）表现出显著的电压依赖性电流。当膜电位超过40 mV时，电流迅速上升，表明通道开放。该通道高度选择性地通透氯离子，几乎不传导钠离子等阳离子，阴离子通透顺序为 Cl⁻ Br⁻ F⁻ NO₃⁻ I⁻。单通道记录显示，tmZC8-3R-BTB的单通道电流与电压呈线性关系，表明其单通道电导恒定；但通道开放概率随电压升高而增加，说明电压通过调节开放概率实现门控。上述结果证实tmZC8-3R-BTB是一种从头设计的电压门控阴离子通道，因此被重新命名为dVGAC（de novo designed Voltage-Gated Anion Channel）。随后，研究团队解析了dVGAC的冷冻电镜结构，分辨率达2.9 Å。结构分析显示，其实际构象与设计模型高度一致，跨膜区Cα原子的RMSD仅为1.09 Å，验证了该通道的精确从头设计。电镜结构中，精氨酸R157的侧链构成孔道最窄处，最小半径为0.5 Å，小于氯离子的半径（约1.8 Å），表明该结构对应于通道的关闭状态。为进一步探究门控机制，研究团队开展了不同电压条件下的分子动力学模拟。结果显示，dVGAC的主链结构在电压变化下保持稳定，而精氨酸约束区的侧链则呈现构象变化。模拟还再现了实验观察到的氯离子选择性通透、阳离子阻断以及电流随电压升高的现象，与设计原理高度一致。

　　由于离子通透性对孔道的化学环境和几何结构高度敏感，研究团队通过改变孔道内的氨基酸残基，成功调控了dVGAC的离子选择性与电压敏感性。他们在孔道不同位点引入带电氨基酸突变，发现dVGAC的L153R突变体表现出与dVGAC不同的阴离子选择顺序：Cl⁻ Br⁻ I⁻ NO₃⁻ F⁻。尤为值得注意的是，dVGAC的R165D突变体（命名为dVGAC1.0）在仅20 mV的膜电位下即可激活，并介导显著电流，且离子选择性顺序与dVGAC保持一致。由于许多神经元在产生动作电位时膜电位可超过20 mV，这提示dVGAC1.0有望用于调控神经元活动。为此，研究团队将表达人工设计离子通道tmZC8-BTB、dVGAC或dVGAC1.0的腺相关病毒（AAV）注射至Prkcd-cre小鼠的杏仁核中央核（CeA）。结果显示，这些设计通道均能在CeA神经元中高效表达。更重要的是，表达dVGAC1.0的神经元放电频率显著降低，而表达dVGAC的神经元放电特性与邻近未感染细胞无异。该结果证实，从头设计的电压门控阴离子通道在生理条件下具备调控神经元活动的能力，为开发用于调控细胞及神经功能的人工通道蛋白药物提供了新思路。

　　该研究在从头设计功能性跨膜蛋白方面取得重要突破，实现了从以往仅能构建“静态”膜蛋白结构，到如今可设计具有“动态”响应能力、能对外界刺激产生构象变化的跨膜蛋白的跨越。这类新型蛋白可像“分子开关”一样，根据环境变化切换构象，在细胞中执行特定功能。研究团队成功从头设计出可由基因编码的电压门控阴离子通道dVGACs，并在哺乳动物细胞和神经元中验证了其功能，展现出调控细胞及神经活动的巨大潜力。值得注意的是，dVGACs的电压激活阈值可按需调节，从而实现对神经元活动的精确控制（图3）。该成果为构建响应特定分子或物理信号的新型跨膜蛋白提供了可行路径，具有广泛的应用前景。

　　研究团队首先从头设计了有漏斗状孔道结构的膜蛋白。他们采用参数化方程结合片段组装策略，从头生成了一个由15根α螺旋组成的五聚体跨膜骨架。随后，利用ProteinMPNN进行序列设计，并通过AlphaFold2筛选出可正确折叠为目标结构的候选序列。进一步通过改造跨膜区表面氨基酸，将可溶性蛋白转化为功能性膜蛋白。生化实验和冷冻电镜结构解析证实了所设计跨膜蛋白的高度准确性，且省略了以往需确定可溶蛋白结构的繁琐步骤。该蛋白内环螺旋形成的漏斗状孔道结构，为通过门控氨基酸的构象变化调控孔径、实现离子通道的开关以及单向离子传输提供了理想框架。

　　该研究首次在蛋白质设计中实现对膜蛋白门控动态构象的功能性编程，标志着膜蛋白设计从“静态”结构迈向“动态”功能的新阶段。通过调节孔道氨基酸组成，可灵活调控通道的激活阈值与离子选择性，为满足不同生物学需求的定制化设计提供了可行路径。这一成果不仅是电压门控阴离子通道的首次精准从头设计，更是蛋白质设计领域的重大突破。所构建的通道dVGACs有望作为“开关型”功能元件，推动新型疗法与检测工具的发展。未来，该策略可拓展至响应光、压力、温度或化学信号的智能蛋白设计，为开发新型生物传感器和功能性蛋白质器件提供理论支撑。若能实现门控机制的多样化及功能模块的可编程组合，将进一步推动人工生命系统的精准调控，开辟全新的生物技术应用方向。

　　该研究创新性地在孔道内部引入“精氨酸约束区”，使其同时承担电压感应与离子选择双重功能，这一设计在自然界尚未被发现。值得注意的是，诺贝尔奖得主Roderick MacKinnon团队曾指出，天然电压门控阴离子通道CLC通过螺旋偶极及主链/侧链上的氮、氧原子与氯离子相互作用，避免与赖氨酸或精氨酸等带完整正电荷的残基直接结合。这是由于强静电势阱可能导致离子结合过强，阻碍高效转运。因此，进化倾向于使用部分正电荷，以平衡离子稳定与传导速率。而卢培龙团队的这一设计与天然电压门控氯离子通道CLC不同，展现了一种新的离子选择和门控机制。

　　该研究首次实现了电压门控阴离子通道dVGACs的精确从头设计，并在结构、功能、细胞乃至组织水平上获得了系统验证。冷冻电镜结果显示设计模型与实际结构高度一致；膜片钳实验与分子动力学模拟共同证实了其电压依赖性与阴离子选择性。特别是对关键门控残基（如R157）构象变化的精准建模，为理解通道开闭状态的转换提供了坚实的实验与理论依据。更重要的是，该人工通道可在哺乳动物大脑神经元中表达并调节动作电位发放频率，首次将从头设计的电压门控离子通道推进至神经生物学研究与应用的前沿。

　　未来研究可在以下方向深入探索：其一，整合多种门控机制（如配体、机械力、光响应），实现对细胞活动的高精度、可编程调控；其二，系统评估人工通道的生理稳定性、免疫原性、递送效率与组织特异性表达；其三，进一步研究其在复杂生理环境中的长期功能，及其对动物行为的影响，评估其在癫痫、抑郁症等神经系统疾病治疗中的安全性与可逆性。结合基因治疗与靶向神经调控技术，人工离子通道有望成为疾病干预与智能生物器件的核心元件，推动新一代精准医学的发展。